El cannabidiol inhibe las respuestas neuroinflamatorias y el circuito

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7907 (2023) Citar este artículo

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El cannabidiol fitocannabinoide no euforígeno (CBD) se ha utilizado con éxito para tratar las epilepsias de inicio en la infancia. Estas condiciones están asociadas con retrasos en el desarrollo que a menudo incluyen el aprendizaje vocal. El canto del pinzón cebra, como el lenguaje, es un comportamiento complejo que se aprende durante un período sensible de desarrollo. La calidad de la canción se mantiene a través del refinamiento sensoriomotor continuo que involucra circuitos que controlan el aprendizaje y la producción. Dentro del circuito motor vocal, HVC es una región similar a la cortical que, cuando se lesiona parcialmente, interrumpe temporalmente la estructura de la canción. Anteriormente descubrimos que el CBD (10 mg/kg/día) mejora la recuperación vocal posterior a la lesión. Los estudios actuales se realizaron para comenzar a comprender los mecanismos posiblemente responsables de la protección vocal de CBD. Encontramos que el CBD redujo notablemente la expresión de mediadores inflamatorios y marcadores de estrés oxidativo. Estos efectos se asociaron con una expresión regionalmente reducida del marcador microglial TMEM119. Dado que la microglía es un regulador clave de la reorganización sináptica, medimos las densidades de sinapsis y encontramos disminuciones significativas en todo el circuito inducidas por lesiones que fueron revertidas en gran medida por el CBD. La protección sináptica estuvo acompañada por la activación de NRF2 y la expresión de BDNF/ARC/ARG3.1/MSK1, lo que implica mecanismos importantes para la mitigación del estrés oxidativo en los nodos del circuito del canto y la promoción de la homeostasis sináptica. Nuestros hallazgos demuestran que el CBD promueve una variedad de procesos neuroprotectores consistentes con la modulación de múltiples sistemas de señalización celular, y sugieren que estos mecanismos son importantes para la recuperación posterior a la lesión de un comportamiento aprendido complejo.

El cannabis y muchas de las moléculas bioactivas que produce se han estudiado durante décadas1. Estos esfuerzos han resultado en la identificación de cientos de fitocannabinoides, de los cuales dos se destacan como terapéuticos: el cannabidiol (CBD) y el Δ9-tetrahidrocannabinol (THC). Hasta hace poco, el interés por el CBD se había visto eclipsado por el enfoque en el THC, que es más dramáticamente efectivo y eufórico. El CBD de acción más sutil ahora está recibiendo una mayor atención terapéutica, ya que se aprobó la comercialización de una formulación de origen botánico en los EE. UU. para tratar los trastornos convulsivos infantiles2.

Estos trastornos convulsivos están asociados con un retraso en el desarrollo del lenguaje3. Las encuestas de cuidadores de los ensayos de epilepsia infantil sugieren que el CBD mejora la comunicación vocal4,5. Para investigar la utilidad potencial del CBD en los trastornos del habla y el lenguaje, hemos utilizado un pájaro cantor de aprendizaje vocal, el pinzón cebra, como modelo animal preclínico.

Al igual que el lenguaje humano, el canto se aprende durante un período sensible de desarrollo6. También como los humanos, el aprendizaje vocal de los pájaros cantores depende del establecimiento de circuitos que unen las regiones cerebrales corticales, estriadas y talámicas7. Los perfiles de expresión génica demuestran claras similitudes entre el aprendizaje vocal de pájaros cantores y humanos8,9 y las regiones motoras10. Por ejemplo, la evidencia respalda las similitudes funcionales entre las capas 2, 3 y 6 de la corteza motora laríngea humana (LMC) y el pájaro cantor HVC (nombre propio), que cada uno impulsa la salida del motor vocal (desde la capa 5 de LMC y el núcleo robusto del pájaro cantor del arcopallium [RA] , respectivamente9).

Anteriormente, al usar un método de microlesión HVC bilateral para alterar la calidad de las vocalizaciones11, descubrimos que los tratamientos diarios con 10 mg/kg de CBD disminuyen la magnitud de la interrupción del canto y mejoran el tiempo de recuperación12. Para el presente estudio, para reducir el impacto animal y permitir controles dentro del sujeto estadísticamente poderosos, adoptamos un enfoque de lesión unilateral. Los resultados iniciales indicaron que, al igual que el método bilateral, las microlesiones HVC unilaterales interrumpen reversiblemente los patrones de canto, pero con una magnitud de efecto más modesta. Además, encontramos que las microlesiones del hemisferio izquierdo producían una mayor interrupción vocal que las microlesiones del hemisferio derecho, lo que concuerda con la lateralización vocal de los pájaros cantores informada por otros13. Tenga en cuenta que debido a que la recuperación depende de la percepción auditiva (las aves sordas no mejoran14), se requiere un reaprendizaje sensoriomotor adulto. Nuestro objetivo actual es mejorar la comprensión de los mecanismos por los cuales el CBD protege la calidad vocal y mejora la recuperación dependiente del aprendizaje de un comportamiento motor complejo.

La evidencia acumulada muestra que el CBD tiene actividad antiestrés antiinflamatoria y antioxidante que implica la activación y migración de células inmunitarias a áreas de lesión del SNC15. Por ejemplo, un estudio de expresión génica que utiliza perfiles genéticos basados ​​en micromatrices indica que el CBD atenúa varios eventos celulares mediante la modulación de la expresión de factores de transcripción proinflamatorios, citocinas y receptores de citocinas (que son notablemente liberados por la microglía y controlados por el regulador maestro antioxidante , NRF216,17). Experimentos más recientes de RNASeq demuestran la expresión alterada por CBD de mediadores inmunitarios en la corteza prefrontal y una probable mejora cognitiva relacionada en un modelo de esquizofrenia en ratas18. En un modelo de ratón con Alzheimer, el CBD estimula el efecto antiinflamatorio del hipocampo y promueve la expresión del gen de la autofagia homeostática19. Dados estos ejemplos de actividad antiinflamatoria del CBD, sospechamos la participación de mecanismos similares en la recuperación vocal. Para comenzar a probar esta posibilidad, investigamos la modulación del CBD de la expresión posterior a la microlesión de citoquinas inflamatorias, marcadores de estrés oxidativo neuronal, infiltración de microglía/macrófagos y cambios relacionados en las densidades sinápticas dentro de las regiones de control de canciones relevantes (Fig. 1).

Resumen de las regiones de interés del cerebro de la canción. (A) Representación esquemática de las regiones cerebrales enfocadas y sus interconexiones. Las microlesiones se dirigen a HVC y producen déficits vocales cuya recuperación depende del aprendizaje sensoriomotor (las aves sordas no se recuperan14). Las flechas rojas representan la vía del prosencéfalo anterior (AFP), un circuito corticobasal de ganglios talámicos fundamental para el aprendizaje vocal y la inducción de la variabilidad vocal durante la edad adulta. Las flechas verdes representan vías motoras vocales. Las regiones discontinuas indican ubicaciones x,y aproximadas de regiones no visibles en el panel B. (B) Es una imagen de campo oscuro representativa que se utiliza para identificar secciones con regiones de interés y definir sus bordes para superponerlas en imágenes obtenidas posteriormente mediante microscopía confocal. Esta imagen se usó para producir el trazado tipo cámara lucida en el Panel A. Tenga en cuenta que la organización nuclear distintiva de las regiones de la canción contrasta con la corteza laminada de los mamíferos y permite la selección de lesiones, disecciones y otras manipulaciones. Rostral es aproximadamente derecha, dorsal arriba y barras = 1 mm. Abreviaturas: HVC (nombre propio), lMAN (núcleo magnocelular lateral del nidopalio anterior), RA (núcleo robusto del arcopalio), Área X (Área X del cuerpo estriado, tenga en cuenta que el cuerpo estriado del pájaro cantor también contiene neuronas e interneuronas de proyección pálida que distinguen anatómicamente del cuerpo estriado de los mamíferos que separa estas características20).

En otros sistemas, el CBD muestra una eficacia antiinflamatoria y antioxidante que es en parte responsable de su actividad neuroprotectora21,22. Para evaluar si la recuperación vocal mejorada con CBD puede implicar una eficacia antiinflamatoria similar, cuantificamos la expresión de varios mediadores proinflamatorios y antiinflamatorios (Fig. 2A-D). Utilizando la técnica de disección con micropunzón (descrita a continuación) 24 h después de las microlesiones, aislamos tejido para la extracción de ARN, la síntesis y amplificación de ADNc de las regiones de la canción dentro de los nodos del motor (HVC y RA) y los circuitos esenciales de aprendizaje (Área X, observe la disección con micropunzón El enfoque utilizado se ilustra en la figura complementaria S2). ANOVA de modelos mixtos reveló que los tratamientos con CBD redujeron significativamente la expresión (en relación con los controles del vehículo) de los mediadores proinflamatorios IL-6 (dentro de HVC por media = 0,615 [0,243–0,987], p = 0,0002; IL-1Β (dentro de HVC por media = 1,33 [0,427–2,222], p = 0,0015 y RA por media = 1,44 [0,542–2,337], p = 0,0005, RA por media = 0,563 [0,192–0,935], p = 0,0008 y Área X por media = 0,435 [0,063-0,807], p = 0,0141, ver Fig. 2A-C). El área lesionada, HVC y RA mostraron una reducción adicional de la expresión de TNFα (HVC en promedio 0,275 [0,087-0,462], p = 0,0016, RA en promedio = 0,292 [0,105–0,48], p = 0,0008), que no fue estadísticamente significativo en el Área X (media = 0,035 [− 0,222–0,153], p = 0,960). Además de disminuir la expresión de mediadores proinflamatorios, el CBD ha También se ha demostrado que regula al alza la citocina antiinflamatoria IL-1023 Cuantificamos las diferencias en la expresión de IL-10 y descubrimos que aumentaban significativamente en HVC de aves tratadas con CBD (media = 0,512 [0,152–0,872, p = 0,0023) y RA (media = 0,487 [0,127–0,846], p = 0,004) pero no en el Área X (media = 0,008 [− 0,368–0,352], p > 0,99, ver Fig. 2D).

El CBD promueve un patrón de expresión génica relacionada con el estrés antiinflamatorio y antioxidante. Las regiones cerebrales de los circuitos de motor vocal (HVC y RA) y de aprendizaje (Área X) se disecaron con micropunch, se extrajo el ARN total, se sintetizó el ADNc y se amplificó mediante PCR. La expresión génica de IL-1B, IL-6, IL-10, TNFα y SOD2 se normalizó al control endógeno (GAPDH) y el cambio de pliegue del hemisferio no lesionado se expresó como 2−∆∆CT. Para cuantificar, el ADNc de n = 5 por grupo se amplificó por triplicado y se calculó el valor del umbral de ciclo promedio (Ct). A continuación, se utilizó el valor medio de Ct para análisis adicionales. (A) El CBD disminuyó significativamente la expresión media en veces de IL-6 proinflamatoria en HVC, RA y el Área X. (B) El CBD disminuyó la expresión media en veces de IL-1Β en HVC y AR, pero no en el Área X. (C) TNFα disminuyó en HVC y RA pero no en el Área X. (D) la expresión media del mediador antiinflamatorio IL-10 aumentó en HVC y RA pero no significativamente en el Área X. (E) Expresión del marcador de estrés oxidativo, la superóxido dismutasa 2 (SOD2) disminuyó en HVC y RA. Tenga en cuenta que el tejido se obtuvo 24 h después de la lesión y, por lo tanto, representa una "instantánea" de la expresión de citocinas inflamatorias que se sabe que varía con el tiempo posterior a la lesión24. Las diferencias de grupo se evaluaron mediante ANOVA de modelos mixtos con la corrección de comparación múltiple de Sidak.

De acuerdo con la eficacia antiinflamatoria, se ha demostrado que el CBD afecta el equilibrio redox a través de la actividad antioxidante tanto directa como indirecta25. La expresión de superóxido dismutasa 2 (SOD2), un gen que codifica la proteína mitocondrial SOD2 responsable de la unión de subproductos de superóxido, mostró una disminución significativa relacionada con el CBD dentro de HVC (por media = 0,8768 [0,269–1,49], p = 0,002), y RA (multiplicación media = 0,701 [0,093–1,31], p = 0,018), pero no en el Área X (multiplicación media = 0,4841 [− 0,124–1,092], p = 0,162, véase la figura 2E).

Para confirmar que la disminución de la expresión de SOD2 se acompañaba de una disminución general del estrés oxidativo, utilizamos el indicador de superóxido dihidroetidio (DHE, véase la Fig. 3). Cuando se oxida, la DHE intercala núcleos marcados de ADN genómico de doble cadena con fluorescencia roja. En el grupo del vehículo, encontramos que las microlesiones aumentaron significativamente la fluorescencia celular total corregida (CTCF) de la tinción de DHE dentro de HVC (media = 52 215 [26 635–77 796], p < 0,0001), RA (en 49 460 [23 880–75 041], p < 0,0001 ) y Área X (por 29 817 [4237–55 397], p = 0,0152, véase la Fig. 3A). Por el contrario, no hubo diferencias significativas en la tinción de DHE entre los hemisferios no lesionados de los animales tratados con vehículo y CBD (Fig. 3B VEH no lesionado frente a CBD no lesionado 3a,b,e,f, I,j). (HVC, por media = 1777 [23.803–27.358], p > 0,9999; RA, por media = 2194 [− 27.775–23.386], p > 0,9999; y Área X, por media = 4280 [− 21.300–29.861], p = 0,9980). Al comparar la tinción de DHE dentro de los hemisferios lesionados de los animales tratados con vehículo y CBD, las intensidades reducidas de CBD dentro de HVC (en promedio = 33,153 [7573–58,734], p = 0.0056), RA (en promedio = 30,998 [5417–56,578], p = 0,0107) y Área X (media = 28 089 [2508–53 669], p = 0,0250, véase la Fig. 3B). Además, al comparar los grupos de tratamiento con sus respectivos controles no lesionados, los tratamientos con CBD redujeron significativamente los cambios relacionados con la lesión en la expresión de DHE en todas las regiones (HVC por media = 181,5 % [53,91–309,1], p = 0,0045; RA por media = 143,6 % [16,04 –271,2], p = 0,0248 y Área X por media = 152,0 % [24,40–279,6], p = 0,0171, véase la Fig. 3C).

El CBD disminuyó las especies reactivas de oxígeno en los hemisferios lesionados, como lo indica la intensidad de la tinción con dihidroetidio (DHE, en rojo). (A) Imágenes confocales representativas que muestran la tinción regional de DHE indicativa de especies reactivas de oxígeno (ROS) en función de la condición y el tratamiento de la lesión. (B) Resumen de la fluorescencia celular total corregida media (CTCF) de la tinción de DHE dentro de cada área utilizando un área circular con un diámetro de 0,5 mm (consulte los métodos para conocer los detalles del cálculo de CTCF). En el grupo del vehículo, las microlesiones aumentaron significativamente la fluorescencia total de la tinción de DHE en HVC, RA y Área X. No se observó un aumento significativo de la tinción de DHE inducida por lesiones en los grupos tratados con CBD. En todas las regiones del cerebro de los hemisferios lesionados, la tinción de DHE fue significativamente menor en los grupos tratados con CBD en comparación con los controles. (C) Comparando el % de medidas transformadas de control de tinción de DHE dentro de los hemisferios lesionados de animales tratados con vehículo y CBD, el CBD redujo las intensidades dentro de HVC, RA y Área X. El tratamiento con CBD redujo significativamente los cambios relacionados con la lesión en la expresión de DHE en todas las regiones como un porcentaje de su respectivo hemisferio de control. Se determinaron los valores medios de gris y se corrigieron para la fluorescencia de fondo usando la intensidad promedio fuera de cada región de la canción estudiada. Se realizaron comparaciones y se determinó la significación usando la corrección de Sidak para comparaciones múltiples siguiendo ANOVA de modelos mixtos (n = 4 por grupo).

Para confirmar que los patrones de expresión génica antiinflamatorios y antioxidantes inducidos por el CBD dan como resultado cambios en el nivel de proteína funcional, utilizamos enfoques de inmunofluorescencia. Medimos la inmunofluorescencia relativa utilizando anticuerpos dirigidos a IL-6, IL-1B e IL-10 y expresamos los resultados como un porcentaje de hemisferios no lesionados (Fig. 4A–F, tenga en cuenta que la selectividad de los anticuerpos utilizados está respaldada por la tinción de bandas predominantes únicas de espera). tamaño: consulte la figura complementaria S6). El CBD redujo significativamente la expresión de la proteína IL-6 relacionada con la lesión en HVC (por porcentaje medio = 128,9 % [62,32–195,4], p = 0,0001) y AR (por 89,37 % [22,84–155,9], p = 0,0063 Fig. 4A, B). Para IL-1Β, el tratamiento con CBD disminuyó significativamente la expresión en HVC (media = 131,2 % [53,55–208,8], p = 0,0007) y AR (media = 115,0 % [37,36–192,6], p = 0,0026, Fig. 4C ,D). La expresión de IL-6, pero no de IL-1B, se reguló diferencialmente en el Área X (IL-6 en un 72,21 % [5,679–138,7], p = 0,031; e IL-1B en un 1,44 % [−76,17–79,04], p > 0,9999, Fig. 4B,D). El CBD aumentó significativamente la IL-10 antiinflamatoria en la AR (media = 54,9 % [9,388–100,4], p = 0,0147) y el Área X (media = 66,5 % [20,96–111,9], p = 0,0030) mientras que no hubo diferencia estadística en el sitio lesionado (HVC por media = 21,4% [− 66,85-24,14], p = 0,5612 Fig. 4E,F).

El CBD altera las densidades de citocinas relacionadas con la inflamación. Los tratamientos diarios con 10 mg/kg se asociaron con la modulación de la expresión de las proteínas IL-1Β, IL-6 e IL-10 24 h después de las lesiones unilaterales de HVC. Se muestran imágenes confocales inmunofluorescentes representativas de la tinción de anticuerpos dirigida a IL-1Β, IL-6 e IL-10 dentro de regiones motoras (HVC y RA) y esenciales para el aprendizaje (Área X). (Aa-Al), imágenes del hemisferio lesionado que muestran una distribución regional representativa de IL-6 en aves tratadas con vehículo frente a las tratadas con CBD. (Ca–Cl), imágenes que demuestran la distribución regional de IL-1Β. (Ea-El), imágenes confocales que demuestran la distribución regional de IL-10. Las imágenes representativas del hemisferio no lesionado se presentan en la figura complementaria S3. B, fluorescencia de IL-6 como cambio porcentual desde el hemisferio de control no lesionado por región de canto y tratamiento farmacológico. El CBD redujo significativamente la expresión de IL-6 en HVC, RA y Area X. D, fluorescencia de IL-1B como cambio porcentual del hemisferio de control no lesionado por región de la canción y tratamiento farmacológico. El CBD disminuyó significativamente la intensidad de IL-1Β en HVC y RA. F, fluorescencia de IL-10 antiinflamatoria como cambio porcentual desde el hemisferio de control no lesionado por región de la canción y tratamiento farmacológico. El CBD aumentó significativamente la intensidad de IL-10 en la AR y el Área X. Las diferencias se determinaron mediante ANOVA de modelos mixtos seguido de comparaciones post-hoc corregidas por Sidak. Se usó el software Image J para analizar las imágenes de la pila z proyectadas a la máxima intensidad y el umbral se aplicó de manera consistente en todas las imágenes para n = 5 por grupo.

La actividad antiinflamatoria y antioxidante del CBD sugiere la participación de la regulación mediada por NRF2 de los procesos redox, mitocondriales e inflamatorios para mantener la homeostasis. Los resultados indican que el tratamiento con CBD aumentó significativamente los niveles nucleares de pNRF2 en todas las regiones de interés: en HVC (media porcentual = 19,6 [3,7–35,4], p = 0,0259), AR (media = 11,65 [2,39–20,9], p = 0,0262 ) y Área X (por media = 7,1 [1,8–12,43], p = 0,0218, Fig. 5B).

El CBD aumenta la localización nuclear del factor de transcripción regulador de la respuesta antioxidante pNRF2. (A), Las imágenes dentro de las regiones de la canción se tomaron del tejido recolectado 24 h después de las lesiones HVC unilaterales. La fila superior (af) es la tinción de pNRF2. La fila inferior (gl) es la tinción de pNRF2 en rojo combinada con la tinción nuclear de Hoechst en azul. (B), tinción nuclear de pNRF2 en las regiones de interés de la canción expresada como porcentaje de la tinción nuclear total. Los resultados indican que el tratamiento con CBD aumentó significativamente el pNRF2 nuclear dentro de HVC, RA y Area X de acuerdo con las respuestas antioxidantes. El software Image J se usó para analizar imágenes de pila z proyectadas a la máxima intensidad y el umbral se aplicó de manera consistente en todas las imágenes. Las diferencias de grupo se determinaron utilizando ANOVA de modelos mixtos seguido de comparaciones post-hoc corregidas por Sidak para n = 4 por grupo.

La activación, el reclutamiento y la fagocitosis de la microglía son respuestas inflamatorias primarias después de una lesión, que se sabe que están mediadas por la liberación de citocinas y la producción de superóxido con efectos posteriores en la cascada del complemento26,27. La evidencia anterior vincula la activación microglial con la elevación transitoria de genes proinflamatorios (es decir, IL-1Β e IL-6) que se han observado en el punto máximo de muerte neuronal durante el daño tisular27. Dados nuestros resultados que muestran una mayor expresión de citocinas proinflamatorias 24 h después de las cirugías de microlesiones, exploramos la posibilidad de que la microglía se involucre como parte del mecanismo de acción del CBD en nuestro sistema. Usando TMEM119 como marcador de microglía, estudiamos la tinción de TMEM119 inducida por lesiones dentro de las regiones de la canción (HVC, RA y Area X) y los efectos del CBD en esta expresión (Fig. 6A). Los resultados indican que dentro de HVC, RA y Área X, los niveles de TMEM119 fueron significativamente más bajos en los animales tratados con CBD en relación con los controles (media del 97,61 % [27,59–167,6], p = 0,0053; 103,8 % [33,77–173,8], p = 0,0031 y en un 87,39% [17,37–157,4], p = 0,0123, respectivamente (Fig. 6B). Tenga en cuenta que nuestro enfoque actual en la microglía representa un primer paso y no excluye la probable participación de otros tipos de células en las respuestas inflamatorias inducidas por microlesiones ( ej., astrocitos reactivos)28.

Los tratamientos con CBD disminuyen la densidad del marcador microglial TMEM119 dentro de las regiones de canto de los hemisferios lesionados. (aa-af), la inmunofluorescencia TMEM119 marca la microglía, en la que está presente una alta densidad de fluorescencia en HVC, RA y Área X tratados con vehículo. La tinción más baja de TMEM119 es evidente en el grupo tratado con CBD. (ag-al), Combinar imágenes de TMEM119 y núcleos teñidos con Hoechst. ( b ) Densidad de TMEM119 expresada como tinción de Hoechst relativa del valor gris medio de TMEM119 como porcentaje del hemisferio no lesionado. Dentro de HVC, RA y Area X, las densidades de TMEM119 fueron significativamente más bajas en los animales tratados con CBD en relación con los controles del vehículo. Las diferencias de grupo se determinaron utilizando ANOVA de modelos mixtos seguido de comparaciones post-hoc corregidas de Sidak para n = 4 por grupo.

Una función crítica de la microglía incluye la limpieza fagocitaria de desechos axónicos y sinápticos después de la degeneración neuronal29. La evidencia de la disminución de la expresión microglial de TMEM119 relacionada con el CBD nos llevó a cuestionar si los tratamientos también protegían las densidades sinápticas. Para medir esto, comparamos la colocalización de los marcadores presinápticos y postsinápticos, VGLUT2 y PSD-95 entre los grupos de tratamiento (Figs. 7, 8, 9, 10). Vimos disminuciones significativas relacionadas con la lesión en las densidades sinápticas. En el grupo del vehículo, las microlesiones unilaterales redujeron la densidad sináptica dentro de HVC (Fig. 10, Veh Unlesioned vs Veh Lesioned) en una media = 0,20/µm2 [0,025–0,38], p = 0,0272), RA en una media = 0,24/µm2 [0,11 –0,37, p = 0,0014) y Área X por media = 0,16/µm2 [0,007–0,31], p = 0,0410). Curiosamente, dentro de los grupos de AR de CBD hubo una disminución significativa en las densidades sinápticas después de la lesión (CBD no lesionado frente a CBD lesionado por media = 0,16/µm2 [0,022–0,30], p = 0,0234), mientras que los cambios en HVC y el Área X fueron insignificantes. Sin embargo, el tratamiento con CBD tuvo un efecto profundo en la densidad sináptica posterior a la lesión en comparación con el vehículo en HVC (Veh Lesioned vs CBD Lesioned, en promedio = 0,19/µm2 [0,002–0,38], p = 0,0476) en AR (en promedio = 0,18/µm2 [0,05–0,32], p = 0,0088 y Área X (en promedio = 0,15/µm2 [0,04–0,26], p = 0,0122). = 0,076/µm2 [− 0,1126–0,2654], p = 0,7154 y Área X (media = 0,094/µm2 [− 0,019–0,21], p = 0,1094), pero las disminuciones siguieron siendo significativas en AR (media = 0,16/µm2 [− 0,022– 0.30], p = 0.0234). Luego cuantificamos la diferencia en la densidad sináptica del hemisferio no lesionado al lesionado como el número de puntos puncta colocalizados como porcentaje del hemisferio de control no lesionado (Fig. 10B). Dentro de HVC y RA, los grupos CBD tenían un aumento significativo en la densidad sináptica posterior a la lesión (HVC por media = 24,4 % [0,4095–48,41], p = 0,0,0464; RA por media = 16,5 % [3,019–29,90], p = 0,0186) mientras que el Área X no difirió significativamente (media = 13,77% [12,02-39,56], p = 0,3336). Aunque no se encontró que fuera significativo, puede ser importante que el tratamiento con CBD tendiera a aumentar las densidades sinápticas en los hemisferios no lesionados en relación con el vehículo, lo que sugiere la promoción de la sinaptogénesis además de la protección de la lesión (Fig. 10A).

Los tratamientos con CBD protegen las densidades sinápticas glutamatérgicas de las pérdidas relacionadas con lesiones dentro de HVC. (a–t) Imágenes confocales representativas de inmunofluorescencia que ilustran la densidad sináptica en cuatro grupos: VEH Unleisoned (a–e), CBD Unlesioned (f–j), VEH Lesioned (k–o) y CBD lesionado (p–t). Las manchas se dividen en columnas con Hoechst, PSD95 (marcador postsináptico) y VGLUT2 (marcador presináptico) respectivamente. La columna cuatro es una combinación de PSD95 y VGLUT2 y la columna 5 muestra una máscara de los puntos puncta colocalizados. Las máscaras de sinapsis muestran que, en relación con los controles de VEH, los grupos de CBD tienen densidades de sinapsis glutamatérgicas significativamente más altas 24 h después de las lesiones.

Los tratamientos con CBD protegen las densidades sinápticas glutamatérgicas de las pérdidas relacionadas con las lesiones dentro de la AR. (a–t) Imágenes confocales representativas de inmunofluorescencia que ilustran la densidad sináptica en cuatro grupos: VEH Unleisoned (a–e), CBD Unleisoned (f–j), VEH Lesioned (k–o) y CBD Lesioned (p–t). La mancha se divide en columnas con Hoechst, PSD95 (marcador postsináptico) y VGLUT2 (marcador presináptico) respectivamente. La columna cuatro es una fusión de las dos manchas y la columna 5 muestra una máscara de los puntos colocados de PSD95 y VGLUT2. Las máscaras de sinapsis muestran que, en relación con los controles de VEH, los grupos de CBD tienen densidades de sinapsis glutamatérgicas significativamente más altas 24 h después de las lesiones.

Los tratamientos con CBD protegen las densidades sinápticas glutamatérgicas de las pérdidas relacionadas con lesiones dentro del Área X. AT, imágenes confocales representativas de inmunofluorescencia que ilustran la densidad sináptica en cuatro grupos: VEH sin lesiones (a–e), CBD sin lesiones (f–j), VEH con lesiones (k– o) y CBD Lesionado (p–t). La mancha se divide en columnas con Hoechst, PSD95 (marcador postsináptico) y VGLUT2 (marcador presináptico) respectivamente. La columna 4 es una fusión de las dos manchas y la columna 5 muestra una máscara de los puntos colocados de PSD95 y VGLUT2. Las máscaras de sinapsis muestran que, en relación con los controles de VEH, los grupos de CBD tienen densidades de sinapsis glutamatérgicas significativamente más altas 24 h después de las lesiones.

Los tratamientos con CBD protegen las densidades sinápticas glutamatérgicas de las pérdidas relacionadas con las lesiones. ( a ) Cuantificación de las densidades sinápticas de la región del canto dentro de los hemisferios no lesionados y lesionados de pájaros cantores tratados con vehículo y CBD. En el grupo del vehículo, las microlesiones unilaterales redujeron la densidad sináptica en las tres regiones examinadas (HVC, RA y Area X). Por el contrario, en el grupo CBD no hubo efectos lesionales significativos en HVC o Area X. Esta protección no fue tan sólida en RA, aunque el déficit disminuyó. El tratamiento con CBD tuvo un efecto profundo en la densidad sináptica posterior a la lesión en comparación con las densidades posteriores a la lesión de las aves tratadas con vehículo en las tres regiones de interés. ( b ) Cambio relacionado con la lesión en la densidad sináptica expresado como puntos puncta colocados transformados en porcentaje del hemisferio de control no lesionado. Dentro de HVC y RA, los grupos CBD tuvieron un aumento significativo en la densidad sináptica posterior a la lesión, mientras que el Área X no difirió significativamente. Esto indica una protección significativa de las sinapsis en áreas clave de la producción vocal. Para el análisis, cada conjunto de imágenes de la pila z se procesó posteriormente y se proyectó a la máxima intensidad. Se definieron puntos de VGLUT-2 y PSD-95 colocalizados dentro de cada región para el análisis de partículas con umbral aplicado de n = 5 animales por grupo. Luego se cuantificaron las densidades de sinapsis glutamatérgicas como cambio porcentual del hemisferio de control no lesionado. Se evaluó la importancia y se realizaron las comparaciones apropiadas utilizando ANOVA de modelos mixtos con la corrección de Sidak para comparaciones múltiples.

La recuperación vocal del pinzón cebra requiere retroalimentación sensoriomotora14, lo que nos llevó a investigar los factores que vinculan la experiencia con la neuroplasticidad y la escala sináptica homeostática30. Al cuantificar la expresión de genes clave relacionados con la plasticidad mediante qRT-PCR, encontramos diferencias significativas entre los grupos de tratamiento en la expresión de BDNF (F[3, 36] = 28,79, p < 0,0001), MSK1 (F[3, 36] = 57,63, p < 0,0001) y ARC/ARG3.1 (F[3, 36] = 46,53, p < 0,0001, Fig. 11).

El CBD influye en la expresión de los reguladores de escala sináptica. Ejes Y = expresión de ARNm de BDNF, ARC/ARG3.1 y MSK1 normalizada al control de limpieza (GAPDH) y expresada como cambio de pliegue de hemisferios no lesionados (2−∆∆CT). Las muestras de ADNc sintetizadas a partir de grupos de n = 4 sujetos se amplificaron por triplicado y se representaron gráficamente las medias. (a) En la AR y el Área X de los hemisferios lesionados, el CBD aumentó significativamente la expresión media de BDNF en relación con los controles de VEH. ( b ) En HVC, RA y Área X de los hemisferios lesionados, el tratamiento con CBD aumentó la expresión media de MSK1 sobre VEH. (c) En la AR y el Área X de los hemisferios lesionados, el CBD suprimió la expresión de ARC/ARG3.1 frente a VEH. Las diferencias de grupo se evaluaron mediante ANOVA de modelos mixtos con la corrección de comparación múltiple de Sidak.

Las comparaciones post-hoc revelaron que en los controles de VEH las lesiones aumentaron significativamente la expresión de BDNF en HVC (en 1,29 veces, IC del 95 % = 0,66—1,92, p < 0,0001) pero no en la AR o el Área X (Fig. 11A). Esto parece estar relacionado con la estimulación de la expresión de BDNF en la región lesionada, HVC, que no se extendió a sus objetivos de proyección, RA y Área X. Esto no fue cierto en los pinzones tratados con CBD donde se observaron diferencias significativas entre las aves del grupo no lesionado y lesionado. observado en cada región del cerebro (en HVC por 1,15, IC del 95 % = 0,52–1,78, p < 0,0001; en AR por 1,01, IC del 95 % = 0,38–1,64, p = 0,0007; en el Área X por 1,02, IC del 95 % = 0,39-1,36, p = 0,0006).

Debido a que la evidencia sugiere que BDNF aumenta la expresión de MSK1 en la plasticidad sináptica relacionada con la experiencia31, investigamos la posible regulación por CBD de la expresión de esta quinasa. Aunque las lesiones tendieron a aumentar la expresión de MSK1 en los controles de VEH, esto solo fue significativamente diferente en el Área X (VEH no lesionado frente a VEH lesionado en 0,68, IC del 95 % = 0,24–1,11, p = 0,0010, fig. 11B). Por el contrario, las aves tratadas con CBD aumentaron significativamente la expresión de MSK1 en cada región del cerebro de interés (en HVC en 1,25, IC del 95 % = 0,81–1,66, p < 0,0001; en RA en 1,08, IC del 95 % = 0,64–1,52, p < 0,0001; en el Área X por 1,01, IC 95 % = 0,38–1,64, p < 0,0001).

En modelos de escalamiento sináptico homeostático, los altos niveles de actividad sináptica aumentan la señalización de la ruta BDNF/MSK132 que promueve la expresión de ARC/ARG3.1. La actividad ARC/ARG3.1 promueve la internalización de los receptores AMPA excitatorios, lo que disminuye la fuerza sináptica excitatoria. Para probar si esta vía de señalización de ARC/ARG3.1 se ve afectada por el tratamiento con CBD en nuestro sistema, medimos los efectos del tratamiento en la expresión de ARC/ARG3.1. Curiosamente, en cada región del cerebro de interés de los controles tratados con vehículo, las lesiones aumentaron significativamente la expresión de ARC/ARG3.1 (en HVC en 0,08, IC del 95 % = −0,40–0,56, p = 0,970; en RA en 0,56, IC del 95 % = 0,079-1,04, p = 0,017, en el Área X por 0,62, IC del 95% = 0,14-1,11, p = 0,0068, Fig. 11C). Comparando aves lesionadas tratadas con vehículo y CBD, la expresión de ARC/ARG3.1 fue significativamente menor en RA y Área X, pero no en HVC, de pinzones tratados con CBD (en RA por 0.56, 95% CI = 0.08—1.04, p = 0,017 y Área X por 0,62, IC del 95 % = 0,14–1,11, p = 0,007). Si, como en otros sistemas, ARC/ARG3.1 actúa para internalizar los receptores AMPA, esperaríamos densidades más altas después de los tratamientos con CBD. Actualmente estamos investigando esta posibilidad.

Estos experimentos se realizaron para identificar mecanismos candidatos que podrían contribuir a la aceleración de la recuperación vocal del CBD observada anteriormente después de las microlesiones de HVC; y comenzar a identificar las regiones motoras y de aprendizaje involucradas. El valor de estudiar la neuroprotección del CBD en pájaros cantores radica en la capacidad de identificar procesos modificados dentro de nodos discretos de circuitos que controlan el aprendizaje y la producción vocal. Las vías de control vocal tanto en los pájaros cantores como en los humanos comparten similitudes funcionales convergentes que aumentan la relevancia de la traducción en relación con las especies de aprendizaje no vocal9,10. Una clara diferencia entre las vías vocales aviares y humanas es la organización nuclear en lugar de laminada de las regiones de control vocal paleal. Esta diferencia imparte ventajas en la selección de regiones para manipulación y evaluación espacial; una característica que hemos aprovechado. Además de HVC (el objetivo de microlesión similar a la cortical premotora), nos hemos centrado en sus objetivos de proyección: RA (similar a la corteza motora) y; Área X (una región estriatal esencial para el aprendizaje que también incorpora neuronas de proyección palidal). Debido a que la recuperación del canto depende de la integración sensoriomotora dependiente de la percepción auditiva (las aves sordas no mejoran14), nuestro sistema modela de manera única la pérdida de un adulto y la recuperación dependiente del aprendizaje de una habilidad motora compleja.

Los resultados demuestran que en el modelo de microlesión de HVC, el CBD tiene poderosos efectos antineuroinflamatorios consistentes con aquellos bien caracterizados en sistemas de mamíferos16 (ver Figs. 2 y 4). Esto es importante ya que la neuroinflamación es un factor etiológico en el desarrollo de un espectro de trastornos del SNC33. Un ejemplo es la neuroinflamación crónica desencadenada por una lesión cerebral postraumática que aumenta la probabilidad de trastornos del estado de ánimo y demencias de aparición temprana34. Dada la administración crónica necesaria para tratar la neuroinflamación crónica, los efectos secundarios significativos y/o la disminución de la eficacia son comunes con las terapias actuales35. Los efectos anti-neuroinflamatorios profundos que nosotros y otros hemos observado usando CBD, combinados con la evidencia de un perfil favorable de efectos secundarios36, sugieren que puede mejorar la capacidad de manejar esta difícil condición.

Un problema potencial del uso terapéutico del CBD es la falta de selectividad. Este fármaco interactúa y modifica la actividad de múltiples dianas celulares37,38. Un problema adicional es el coaislamiento de otras moléculas potencialmente bioactivas. Los extractos de CBD purificados contienen al menos trazas de otros cannabinoides, incluido el THC39 activo en el SNC. Hemos encontrado que la eficacia del CBD está influenciada por el contenido de THC, lo que subraya la importancia de formulaciones consistentes y cuidadosamente controladas40. Al identificar las vías afectadas por el tratamiento con CBD, es posible identificar fármacos más selectivos, lo que reduce los posibles efectos secundarios. Alternativamente, un séquito de diversas interacciones celulares del CBD puede ser clave para la eficacia y necesario para la neuroprotección. El modelo de microlesión se muestra prometedor para identificar mecanismos anti-neuroinflamatorios y detectar nuevos fármacos potenciales.

Los efectos antiinflamatorios del CBD aparecieron más en la región microlesionada, HVC, y en grados progresivamente menores dentro de RA y Area X (p. ej., Fig. 2A-C). Esto coincide con la proximidad a HVC, consistente con el impacto esperado en proyecciones degenerativas más cortas que preceden a las más largas (observe la evidencia de tinción de cúprico-plata para esto en la Fig. 7 complementaria). Debido a que RA integra la salida tanto de la vía de aprendizaje del prosencéfalo anterior (AFP) asociada al Área X, como de la vía motora posterior (a través de HVC, ver Fig. 1), esperábamos una entrada motora interrumpida antes que la del circuito de aprendizaje AFP41. La AFP tiene una función generadora de errores que introduce una variabilidad vocal crítica para el aprendizaje sensoriomotor y modula la actividad tanto en RA42 como en HVC (indirectamente a través de los núcleos dopaminérgicos del mesencéfalo43). La persistencia de la generación de errores de AFP, en condiciones de control motor HVC reducido, es consistente con la interrupción vocal inducida por microlesión. Esto puede explicar por qué se observan efectos mínimos de microlesión en aves con deficiencia de AFP11.

Otra posible explicación de las diferencias regionales en la capacidad de respuesta antiinflamatoria es el momento de estos procesos que a menudo son coordinados y secuenciales44. Debido a que investigamos solo un único punto de tiempo de 24 h, no sabemos si las respuestas recién comenzaban, terminaban o alcanzaban la magnitud máxima.

Un segundo mecanismo identificado incluyó la mitigación del estrés oxidativo con CBD, como lo indican los efectos sobre la expresión de SOD2 dentro de HVC y RA (Fig. 2E). Los efectos del estrés oxidativo se confirmaron aún más mediante la reducción de la tinción de DHE activada por superóxido45 (Fig. 3). Al igual que las citoquinas, la magnitud de la producción de superóxido varió con la proximidad de la lesión, pero el CBD disminuyó significativamente en HVC y RA (Fig. 3B). Tenga en cuenta que las medidas regionales de fluorescencia DHE se expresan en relación con las regiones circundantes y, por lo tanto, demuestran efectos selectivos dentro del circuito de la canción.

La combinación de actividad antiinflamatoria y antioxidante del CBD sugirió la participación de una respuesta de estrés organizada de orden superior. De acuerdo con esto, la señalización está controlada por NRF2, un regulador central establecido de mediadores redox, mitocondriales e inflamatorios. En condiciones basales, NRF2 es una proteína citoplasmática que ante el estrés oxidativo se activa por fosforilación17. El fosfo-NRF2 activado se transloca al núcleo, donde actúa como un factor de transcripción que regula una serie de genes implicados en las respuestas antioxidantes, autofágicas, de proteínas mal plegadas y otras respuestas celulares46. Los aumentos significativos relacionados con el CBD en el fosfo-NRF2 nuclear observados en nuestro sistema (ver Fig. 5) implican esta vía homeostática en nuestro modelo. El hecho de que el CBD efectivamente: (1) reduce el estrés oxidativo que normalmente activa NRF2 y; (2) el aumento de la translocación nuclear de pNRF2, sugiere que la actividad antioxidante del CBD está aguas abajo de la activación de pNRF2, o que el CBD puede activar NRF2 a pesar de la reducción de las especies de oxígeno reactivo (o alguna combinación de ambas posibilidades). Serán necesarios experimentos adicionales que investiguen los efectos dependientes del tiempo del CBD para aclarar la naturaleza de la señalización de NRF2 en este sistema. Tenga en cuenta que otros activadores de la señalización de NRF2 son antiinflamatorios clínicamente relevantes47. NRF2 también es potentemente activado por el antioxidante sulforafano de origen botánico, un derivado del cual se está evaluando actualmente en la hemorragia del SNC48. Estos fármacos más selectivos son candidatos para la evaluación antineuroinflamatoria en el sistema de microlesiones HVC.

El tipo de expresión de citoquinas proinflamatorias que observamos después de las microlesiones (descritas anteriormente) está, en otros sistemas, asociado con la activación microglial, infiltración y fagocitosis de desechos celulares. Estas actividades pueden ser de importancia clave para la recuperación neuronal frente a la apoptosis26. Esto nos llevó a investigar la posible actividad relacionada con la microglía después de las microlesiones de HVC y la recuperación vocal mejorada con CBD. Tenga en cuenta que esta investigación de la participación de microglia representa un primer paso inicial. Es muy probable que otros tipos de células participen tanto en la inflamación inducida por lesiones como en la actividad antiinflamatoria del CBD (p. ej., astrocitos reactivos)28. Los experimentos que utilizan marcadores adicionales están planificados actualmente y darán como resultado una caracterización más completa de los tipos de células activas y relevantes para nuestro sistema.

Actualmente, al usar TMEM119 como marcador de microglía49, encontramos que el CBD redujo significativamente las densidades de tinción de acuerdo con la infiltración reducida de células mieloides (Fig. 6A, B). Esto es interesante ya que sugiere que la actividad de las células mieloides inducida por daños, en el único punto de tiempo temprano de 24 h que investigamos, está asociada con efectos disruptivos de las microlesiones, y no con la neuroprotección. La apariencia celular redondeada de las células teñidas con TMEM119 24 h después de la lesión sugiere, pero no prueba, que las microlesiones aumentan la densidad de la microglía en un estado fagocítico activado y que los tratamientos con CBD reducen esto (como se muestra en la Fig. 6Aa-b). En el futuro, será importante investigar un curso temporal más completo de los efectos de las lesiones. Otra advertencia sigue a la evidencia reciente que sugiere que TMEM119 puede no distinguir la microglía de los macrófagos periféricos migratorios de manera tan confiable como se pensaba anteriormente, y que no distingue los estados activados de los inactivos50. Debido a que la microglía puede adoptar un continuo de estados de activación: desde subtipos proinflamatorios "similares a M1" hasta antiinflamatorios "similares a M2"51, será importante en estudios futuros medir múltiples marcadores para distinguir los tipos y la actividad de las respuestas de las células mieloides50 ,52. A diferencia de otras medidas relacionadas con el CBD, los efectos sobre las densidades de TMEM119 aumentadas por lesiones no se revirtieron a los niveles de control sin lesiones (Figura complementaria S4). Una hipótesis que estamos probando actualmente es la capacidad del CBD para cambiar las poblaciones relativas de especies microgliales proinflamatorias a antiinflamatorias.

Una función clave de los subtipos microgliales antiinflamatorios y otras células mieloides28 en la recuperación del daño del SNC incluye la preservación de las densidades sinápticas53. La posible protección/promoción del CBD de la densidad sináptica se probó midiendo la colocalización de PSD95 y el marcador glutamatérgico presináptico VGLUT2 (tenga en cuenta que las proyecciones de HVC al Área X y RA son glutamatérgicas54). Como era de esperar, en relación con los hemisferios no lesionados, las microlesiones de HVC parecían disminuir las densidades dentro de la propia región, y también dentro de sus objetivos de proyección (Figs. 7 y 10b, ver también evidencia de degeneración de cobre y plata [Fig. Suplementaria S7]). Menos esperado, el CBD aumentó la colocalización de marcadores sinápticos dentro de los hemisferios no lesionados en relación con los controles de VEH, lo que sugiere la promoción de la sinaptogénesis de novo. Si la actividad sinaptogénica se acompaña de sinaptoprotección adicional sigue siendo una pregunta abierta (Figs. 7, 8, 9). La disminución de la magnitud de la interrupción vocal observada después de los tratamientos con CBD sugiere una protección potencial de los circuitos establecidos durante el aprendizaje de canciones. Facilitar el establecimiento de nuevas sinapsis puede ser la base de la promoción del CBD de la recuperación vocal dependiente del aprendizaje sensoriomotor.

Un mecanismo por el cual el CBD puede proteger las sinapsis excitatorias es a través de la modulación de la escala sináptica. Este proceso homeostático gobierna la sensibilidad sináptica bajo varios estados de excitación55. La escala sináptica está regulada por una red compleja de proteínas y vías de señalización, que incluyen BDNF, MSK1 y Arc/Arg3.132,56. BDNF activa MSK1 que a su vez actúa para alterar la expresión de Arc/Arg3.131. Arc/Arg3.1 regula directamente la localización sináptica de los subtipos de receptores AMPA excitatorios de una manera fundamental para la protección homeostática de la plasticidad relacionada con el aprendizaje y la consolidación de la memoria57. La actividad de Arc/Arg3.1 aumenta la internalización de los receptores AMPA excitatorios, disminuyendo y reduciendo la fuerza sináptica excitatoria. Esta regulación puede proteger contra la excitotoxicidad pero, en la medida en que los patrones de expresión del receptor AMPA son importantes para el mantenimiento de los circuitos de canto establecidos durante el aprendizaje vocal, el aumento de Arc/Arg3.1 puede resultar en la interrupción vocal observada en las aves tratadas con vehículo. Las magnitudes reducidas de la interrupción vocal observada en las aves tratadas con CBD pueden deberse a la reducción de la escala sináptica después de la excitotoxicidad relacionada con la lesión (evidente de la tinción de CuAg, Fig. S7 complementaria).

En conjunto, nuestros resultados demuestran poderosos mecanismos antiinflamatorios y sinaptoprotectores de la acción del CBD después del daño a una región similar a la cortical premotora. Esta eficacia está asociada con la promoción de múltiples mecanismos relacionados con la homeostasis dentro de los circuitos del canto. Los estudios futuros pueden vincular estos efectos con la recuperación vocal dependiente del aprendizaje demostrada previamente.

A menos que se indique lo contrario, todos los materiales y reactivos se adquirieron de Sigma Aldrich o Thermo Fisher. El CBD de origen botánico (≥ 98 %) fue proporcionado por GW Research Ltd, Cambridge, Reino Unido. Las reservas concentradas de CBD se prepararon utilizando ETOH al 100 % rociado con nitrógeno y se almacenaron a -20 °C. A continuación, las reservas se diluyeron con vehículo (2:1:17, ETOH:Alkamuls:PBS) para producir suspensiones para inyecciones de 10 mg/kg de CBD. Las dosis de etanol resultantes fueron de 0,33 mg/kg, más bajas que las consumidas voluntariamente por los pinzones cebra58. El isoflurano (Pivetal, NDC 46,066-755-03) utilizado para la anestesia fue proporcionado por el Departamento de Medicina Comparada de la Universidad de Carolina del Este.

Las reservas de CBD, preparadas como se describe anteriormente, se almacenaron en viales estériles con tapón de septo de 5 ml a 4 °C. Se prepararon caldos frescos al menos semanalmente. Para las inyecciones, las preparaciones de fármacos se cargaron en una jeringa de insulina estéril de 1 cc con agujas de calibre 30. En la mañana de las inyecciones, mientras las luces estaban apagadas, las aves fueron capturadas a mano y el sitio de la inyección del músculo pectoral fue expuesto mediante esteras de plumas con un pequeño volumen de ETOH al 70 % administrado mediante una botella rociadora. Se realizaron inyecciones de 50 µl en uno de los cuatro cuadrantes del pectoral, rotando diariamente para minimizar el daño potencial causado por tratamientos repetidos.

Los experimentos duraron 8 días. Se administraron seis inyecciones IM diarias de 15 μl antes de los procedimientos quirúrgicos para permitir que el CBD, un fármaco lipofílico con un gran volumen de distribución y una larga vida media de eliminación, se aproximara a los niveles del estado estacionario59. El día 7, a las aves se les administró una inyección preoperatoria y se realizaron cirugías de microlesiones unilaterales de acuerdo con los métodos que se detallan a continuación. Tenga en cuenta que las microlesiones HVC unilaterales interrumpen significativamente, pero temporalmente, las vocalizaciones de una manera consistente con el enfoque bilateral utilizado anteriormente, excepto que la magnitud de las interrupciones se redujo de manera predecible (consulte la Fig. S1 complementaria). Los efectos conductuales máximos de las microlesiones HVC unilaterales se observaron a las 24 h después de la microlesión, que es el punto de tiempo utilizado para los presentes experimentos. El día 8, a las aves se les administró una inyección postoperatoria de CBD por la mañana y se les practicó la eutanasia por la tarde para la extracción de ARN o la perfusión y el aislamiento del tejido cerebral fijado con paraformaldehído. Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y normativas pertinentes.

Pinzones cebra machos adultos (> 90 días de edad) se criaron en nuestro aviario de reproducción y se mantuvieron a 78 °F en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12. Los machos se utilizaron exclusivamente debido a su capacidad para producir canciones. Las aves se alojaron en jaulas estándar para pinzones (9″ × 11″ × 17″) con alimento y agua ad libitum. Las aves se aislaron visualmente pero no auditivamente, de acuerdo con experimentos anteriores realizados en cámaras de grabación12. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado de animales de la Universidad de Carolina del Este (consulte las declaraciones de ética a continuación) y este estudio se realizó y se informó de acuerdo con las pautas ARRIVE60.

Para reducir el impacto animal y mejorar el poder estadístico, modificamos nuestro modelo original de microlesión bilateral12 para adoptar un enfoque unilateral que permita a los sujetos individuales servir como su propio control interno. Nos dirigimos a los hemisferios izquierdos, ya que la evidencia indica una lateralización similar a la característica del lenguaje humano61, lo que ilustra aún más los paralelismos entre el habla y el canto de los pájaros (también, los experimentos de optimización iniciales sugirieron que la microlesión HVC del hemisferio izquierdo interrumpió la calidad vocal en mayor grado que las que se dirigen a los hemisferios derechos, consulte la Fig. S1 complementaria). ). Con excepción de la modificación bilateral, las microlesiones se realizaron como se describió anteriormente12. Brevemente, utilizando un sistema de anestesia MIDMARK VMS (91 800 003 VMS), las aves se anestesiaron inicialmente con isoflurano al 3 % (vaporizado con un transportador de oxígeno a un caudal constante de 1,0 l/min). Se quitaron las plumas de la parte superior y posterior de la cabeza y se aseguraron las aves en un instrumento estereotáxico con dos varillas de metal insertadas en el canal auditivo y el pico colocado en la barra del pico. Adherido a la barra del pico había un tubo de calibre 20 para el suministro constante de isoflurano durante el procedimiento. La bifurcación en el seno sagital medio se utilizó como cero estereotáxico. Se colocaron pequeñas craneotomías sobre el HVC izquierdo (después de la extracción de la sección del cráneo, el isoflurano se redujo al 2%). Para la destrucción de aproximadamente el 8% del HVC izquierdo, se seleccionaron dos ubicaciones: 2,4 y 2,8 mm desde el cero estereotáxico hasta una profundidad de 0,6 mm. Las microlesiones se realizaron con 100 µA durante 35 s. Después de lesionar, se redujo el isoflurano al 1% antes de suturar. Las aves se recuperaron en una incubadora caliente y se devolvieron a las cámaras de registro. Tenga en cuenta que estos métodos se adaptaron de los desarrollados originalmente por Thompson y Johnson, 200711. También tenga en cuenta que nuestro estudio anterior12 que demostró la eficacia del CBD para mejorar la recuperación vocal empleó un modelo de lesión bilateral, y no el enfoque unilateral adoptado aquí. Esta es una limitación, ya que no demostramos la eficacia del CBD para mejorar la recuperación vocal siguiendo nuestro método de lesión lateral revisado. Por lo tanto, los mecanismos que identificamos como asociados con la eficacia del CBD no están causalmente relacionados con la demostración previa de una recuperación vocal mejorada.

Los experimentos de expresión génica se realizaron con tres réplicas biológicas de cuatro a cinco pinzones cebra adultos por grupo de tratamiento. Para cada animal, se usó una herramienta de perforación de biopsia de 1 mm de diámetro libre de ARNasa estéril para extirpar tejido cerebral de tres regiones de interés, de cada hemisferio (derecho no lesionado utilizado como control interno e izquierdo lesionado): HVC; REAL ACADEMIA DE BELLAS ARTES; y Área X. Las imágenes de ejemplo se muestran en la Fig. S2 complementaria. Las muestras de cerebro se homogeneizaron en reactivo TRIzol (Invitrogen, 15 596 026), se separaron con cloroformo y se precipitaron con isopropanol. El ARN precipitado se lavó y se resuspendió en agua libre de ARNasa. La calidad del ARN se confirmó mediante electroforesis en gel. Se usó ARN total (250 ng) para sintetizar ADNc usando un kit de síntesis iScript (Bio-rad, 1.708.890). Las reacciones completadas se diluyeron cinco veces, por triplicado usando agua libre de ARNasa. La PCR se realizó utilizando la supermezcla verde SYBR (Bio-Rad, 1.725.271). La amplificación selectiva se confirmó usando un análisis de curva de fusión y los datos se obtuvieron como valores de umbral de ciclo (Ct) usando el software CFX Manager (Bio-Rad). La expresión génica se normalizó con respecto al control endógeno (GAPDH) y se determinó el cambio de veces del hemisferio no lesionado utilizando el método ΔΔCt62. Las secuencias de cebadores y la información se encuentran en la Tabla complementaria S1.

A pinzones cebra machos adultos (n = 3-5) se les administraron tratamientos farmacológicos durante 6 días, se microlesionaron el día 7 y se realizaron perfusiones transcardiales 24 h más tarde utilizando paraformaldehído al 4% para la fijación y sacarosa al 30% para la crioprotección. Los cerebros fijos se bloquearon en la línea media, se colocaron en medio de inclusión de OCT, se congelaron usando una suspensión de 2-metilbutano y hielo seco, luego se seccionaron a 10 µm usando un criostato mantenido a -20 °C. Las secciones parasagitales de los hemisferios derecho e izquierdo de cada ave se montaron en portaobjetos Superfrost Plus y se almacenaron a -20 °C.

Los portaobjetos se bloquearon con suero de cabra normal al 5 % durante 1 hora a 37 °C. Los anticuerpos primarios dirigidos a diversas proteínas se diluyeron en suero de cabra normal al 2 % y se usaron en concentraciones optimizadas: anti-IL-6, 10 µg/ml (Biomatik, CAU30440); anti-IL-1B, 10 µg/ml (Mybiosource, MBS 2.090.494); anti-IL-10, 1:100 (BIOSS, AGO7251283); anti-PSD95, 1:50 (Santa Cruz, SC-32291); GLUT2 antivesicular (VGLUT2) 1:500 (Señalización celular, 715,555); anti-TMEM119, 1:100 (Abcam, AB185337); NRF2 antifosforilado (pNRF2), 1:200 (Abcam, AB76026); y contratinción nuclear Hoechst, 1:10.000 (Thermo Fisher Scientific, H3570). La especificidad del anticuerpo primario se validó mediante transferencia Western, cuyas imágenes se resumen en la figura complementaria S6. Todos los anticuerpos primarios se incubaron a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, los portaobjetos se lavaron con PBS y luego se incubaron en el anticuerpo secundario correspondiente diluido en suero de cabra normal al 2 % a 37 °C durante 1 hora. Los anticuerpos secundarios fueron Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón (A32723) Alexa Fluor 647 cabra anti-ratón (A32728) Alexa Fluor 647 cabra anti-conejo (A32733). Después de una hora de incubación en el anticuerpo secundario, los portaobjetos se lavaron dos veces con PBS durante cinco minutos cada uno, seguido de una contratinción nuclear de Hoechst. Después del cuarto y último lavado, los cubreobjetos se colocaron en los portaobjetos utilizando un medio de montaje antidecoloración de diamante (Invitrogen, P36961). Las reacciones de control se realizaron sin anticuerpos primarios para demostrar la falta de una unión no específica significativa de anticuerpos secundarios (ver Fig. S8).

Se realizaron análisis de transferencia Western para determinar la especificidad de los anticuerpos primarios utilizados con tejido de pinzón cebra (consulte la Fig. 6 complementaria). Para cada transferencia, se prepararon muestras de proteína a partir de tejido cerebral homogeneizado (Fisher Scientific, PowerGen 1000 S1) en tampón de lisis y extracción RIPA (Thermo, 89,900) con inhibidor de proteasa (Thermo, A32953). Después de la homogeneización, la mezcla se agitó en un Rotomix durante 2 horas a 4 °C. Luego, el tejido se centrifugó a 16 000 g durante 20 min a 4 °C, se desechó el sedimento y se recogió el sobrenadante. El tampón de lisis con inhibidor de proteasa se preparó de nuevo para cada extracción. La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, 23,227) utilizando tampón de lisis como diluyente para el ensayo y las diluciones posteriores.

Para la separación electroforética, se cargaron 4 µL de la escalera de proteína de precisión más doble color (Bio-Rad, n.º 1,610,374) en el carril 1 de un gel Mini-PROTEAN TGX al 10% (Bio-Rad, n.º 4,561,034) seguido de 20 µg de pinzón cebra proteína cerebral (desnaturalizada con tampón de carga 4 × laemmli a 95 °C durante 5 min) en el carril 2. La electroforesis se realizó a 100 V constantes durante 75 min. La proteína se transfirió a una membrana de PVDF activada con metanol utilizando un sistema Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, 1.704.150) con parámetros determinados por el peso molecular respectivo. Luego, la membrana se bloqueó en BSA al 5 % filtrado en TBST al 0,1 % durante 3–4 h a 37 °C. Se eliminó el tampón de bloqueo, se agregaron 7 ml de anticuerpo primario diluido en TBST al 0,05 % y luego se incubó en un balancín a 4 °C durante la noche. Los anticuerpos se optimizaron y las concentraciones utilizadas fueron las siguientes: anti-IL-6, 10 µg/ml (Biomatik, CAU30440); anti-IL-1B, 2 µg/ml (Mybiosource, MBS 2.090.494); Anti-IL-10, 1:1000 (BIOSS, bs-0698R-TR); anti-PSD95, 1:100 (Santa Cruz, SC-32291); GLUT2 antivesicular (VGLUT2) 1:1000 (Señalización celular, 715,555); anti-TMEM119, 1:200 (Abcam, AB185337); NRF2 antifosforilado (pNRF2), 1:1000 (Abcam, AB76026). Todos los tampones de dilución se prepararon frescos antes de su uso. Al día siguiente, se eliminó el anticuerpo primario y se lavó la membrana 4 veces con TBST al 0,1 % durante 10 min cada vez. Después del cuarto lavado, las membranas se incubaron en el anticuerpo secundario apropiado durante 1 h en un balancín a 37 °C. Los anticuerpos secundarios fueron IRdye 680RD Goat anti-conejo 1:10,000 (Licor, 925–68,071) e IRdye 800CW Goat anti-ratón 1:10,000 (Licor, 925–32,210). Después de la incubación, se eliminó el anticuerpo secundario y se lavó la membrana 4 veces con TBST al 0,1 % durante 10 min cada vez. Después de los lavados, las imágenes se capturaron utilizando un Odyssey M Imager (Licor, M3350).

Los aniones superóxido se detectaron mediante dihidroetidio 5 µM (DHE, Invitrogen, D11347) siguiendo un protocolo descrito anteriormente63. DHE permea libremente las membranas celulares y reacciona con el superóxido citosólico (O2-) produciendo etidio que emite una fluorescencia roja al unirse al ADN. Esta fluorescencia puede luego cuantificarse64. Brevemente, el tejido cerebral se diseccionó rápidamente y se congeló instantáneamente en compuesto OCT utilizando una suspensión de 2-metilbutano en hielo seco. Usando un micrótomo de congelación (Epredia Microm HM525 NX Cryostat), se cortaron secciones de 10 µm y se montaron en portaobjetos de microscopio Fisher Superfrost Plus y luego se pipeteó suavemente 1 ml de DHE 5 µM diluido en PBS en cada portaobjetos y se incubó a 37 °C durante 30 min. protegido de la luz, enjuagado dos veces con PBS y fotografiado.

Las imágenes de campo oscuro para la identificación regional se obtuvieron utilizando el software Image-Pro Plus (versión 6.3) y un microscopio Olympus BX51 equipado con un condensador de campo oscuro a 12.5X (Fig. S2 complementaria). Los bordes de las regiones de interés se trazaron a partir de imágenes de campo oscuro para su posterior superposición sobre imágenes confocales fluorescentes. Las regiones de interés incluyeron HVC fuera de infartos, RA y Área X. Se identificaron secciones que contenían partes de las tres regiones de interés para garantizar una representación equitativa en todas las condiciones de tratamiento. Las imágenes fluorescentes se obtuvieron usando un microscopio de barrido láser Zeiss (LSM, 700 Axio Observer) con objetivos 40X (Plan-Apochromat/1.4 Oil DIC M27) ​​y 10X (EC Plan-Neofluar/0.30 M27). Usando el software de imágenes Zeiss ZEN Black, las imágenes de la pila Z se compilaron usando 5 cortes y se analizaron después de superponer a la máxima intensidad usando la Imagen J.

El software Image J se usó para analizar imágenes superpuestas de la pila z convertidas a 8 bits con un umbral aplicado de manera consistente en todas las imágenes dentro de cada región. Todos los archivos de imagen en formato CZI se exportaron desde el software ZEN Black como archivos tiff en escala de grises y se consolidaron en una proyección z de máxima intensidad. Para IL-6, IL-1B e IL-10, se cuantificó el valor medio de gris de la tinción individual en relación con la tinción nuclear de Hoechst por región de canto como un porcentaje del hemisferio de control. Tenga en cuenta que las medidas de fluorescencia relativa sin transformar y sin procesar de la expresión de citocinas para los hemisferios lesionados y no lesionados se resumen en la figura complementaria S5. Para DHE, se determinaron los valores grises medios y se corrigieron por fluorescencia de fondo usando la intensidad promedio fuera de cada región de la canción estudiada (Fig. 3B). Los grupos se compararon utilizando un porcentaje del hemisferio de control (Fig. 3C). Se usó la fluorescencia celular total corregida media (CTCF) para eliminar el fondo usando un área circular constante (diámetro circular de 0,5 mm): CTCF = Densidad integrada (intensidad media de la región de la canción * intensidad media del fondo). Para el análisis de la localización nuclear de pNRF2, se utilizó el umbral de color para determinar: (1) el área de pNRF2 colocada con tinción nuclear de Hoechst y (2) el área total de tinción nuclear de Hoechst. Luego, el área nuclear de pNRF2 se expresó como un porcentaje del área nuclear total y se comparó entre grupos (Fig. 4B). Para el análisis del marcador de microglía TMEM119 dentro de cada región, el valor gris medio de la tinción de TMEM119 se normalizó a los núcleos teñidos con Hoechst y se calculó como cambio porcentual del hemisferio de control no lesionado (Fig. 6B). Por último, las densidades de sinapsis glutamatérgicas se determinaron mediante la colocalización de VGLUT2 y PSD95 por área de medición (diámetro circular de 100 µm).

Los animales se utilizaron siguiendo los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Este (ECU-IACUC). ECU-IACUC supervisa una instalación de investigación registrada bajo la Ley de Bienestar Animal (#55-R-0010) y tiene una Declaración de Garantía de Bienestar Animal aprobada con la Oficina de Bienestar Animal de Laboratorio D16-00,294. Además, ECU ha continuado con la acreditación completa de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). Se confirmó que este trabajo que involucra animales, específicamente pinzones cebra machos adultos, sigue todas las pautas de ARRIVE60 que incluyen, entre otros, la planificación de la experimentación y la realización de la investigación aprobada, así como la redacción y revisión del manuscrito para garantizar que toda la información esté disponible y sea fácilmente accesible.

Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 9.2.0 para todos los datos histológicos, de comportamiento y de expresión génica. Los datos se expresan como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando un ANOVA de modelos mixtos seguido de un análisis post hoc de Sidak para identificar las diferencias entre los grupos. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p ≤ 0,05. Los resultados estadísticos se indican en el texto y las leyendas de las figuras.

Los conjuntos de datos utilizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Agradecemos al Dr. Alessandro Didonna por la cuidadosa revisión de nuestro manuscrito y por compartir generosamente su experiencia relacionada con la neuroinflamación. También agradecemos el asesoramiento técnico y metodológico del Dr. Srinivas Sriramula, el Dr. Alexis Papariello, Cindy Kukoly y Michelle Cobb. Este trabajo fue financiado en parte por GW Pharmaceuticals y por el Departamento de Farmacología y Toxicología de la Escuela de Medicina Brody de la Universidad de Carolina del Este.

Departamento de Farmacología y Toxicología, Facultad de Medicina Brody de la Universidad de Carolina del Este, Greenville, NC, 27834, EE. UU.

Mark Tripson y Ken Soderstrom

Departamento de Anatomía y Biología Celular, Escuela de Medicina Brody, Instituto de Diabetes y Obesidad de Carolina del Este, Universidad de Carolina del Este, Greenville, NC, 27834, EE. UU.

Karen litwa

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MT, KS y KL conceptualizaron y diseñaron experimentos, analizaron datos y colaboraron en la revisión del manuscrito. MT realizó los experimentos y redactó el manuscrito. Todos los autores leyeron y contribuyeron significativamente a este informe.

Correspondencia a Ken Soderstrom.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Tripson, M., Litwa, K. & Soderstrom, K. El cannabidiol inhibe las respuestas neuroinflamatorias y la pérdida sináptica asociada al circuito después del daño a una región similar a la cortical premotora vocal de un pájaro cantor. Informe científico 13, 7907 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34924-z

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Recibido: 09 febrero 2023

Aceptado: 10 de mayo de 2023

Publicado: 16 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34924-z

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